Ini terdiri dari asam amino individu yang dihubungkan oleh ikatan kovalen, yang disebut ikatan peptida, selama proses translasi protein.
Protein secara konstan diterjemahkan dan didegradasi di dalam sel untuk memastikan konsentrasi protein fungsional yang memadai untuk menyelesaikan berbagai fungsi seluler.
Proses pemecahan protein, yang disebut proteolisis, memecah protein menjadi asam amino individu. Proteolisis dilakukan oleh protease, sejenis enzim yang mekanismenya bergantung pada kelas protease tertentu.
Mereka melakukan banyak fungsi penting dalam sel, termasuk pembekuan darah, pencernaan makanan, apoptosis, dan autophagy.
Proses ini sangat penting dan karena itu protease harus berfungsi secara efisien untuk memastikan kelangsungan hidup organisme.
Ada banyak jenis yang berbeda di setiap sel setiap organisme, dan enzim ini berfungsi di berbagai wilayah sel, dengan kekhususan dan mekanisme aksi yang berbeda.
Proteolisis dalam Isolasi Protein
Aktivitas protease sangat diatur dalam sel, dan regulasi ini terjadi melalui berbagai mekanisme.
Contoh aktivasi protease yang diatur adalah selama inisiasi apoptosis atau kematian sel terprogram. Aktivasi caspase dan pembelahan protein hilir berikutnya memainkan peran penting dalam apoptosis.
Sebagian besar caspases seluler ada sebagai procaspase (versi tidak aktif) yang harus dibelah secara proteolitik untuk menunjukkan aktivitas protease.
Protein dalam IAP (inhibitor of apoptosis) memblokir apoptosis dari famili baik dengan mencegah pembelahan procaspase atau dengan secara langsung menghambat aktivitas caspase.
Aktivitas protease juga dapat dikontrol oleh lokasi selulernya. Beberapa protease diasingkan dalam organel tertentu sedemikian rupa sehingga mereka hanya dapat mendegradasi protein yang ditargetkan ke lokasi seluler yang sama.
Misalnya, cathepsin adalah protease yang sebagian besar terlokalisasi pada lisosom . Protease ini mendegradasi protein yang ditargetkan ke lisosom untuk degradasi.
Dalam sel utuh, protein yang tidak terlokalisasi dalam lisosom tidak bersentuhan dengan protease khusus ini dan oleh karena itu tidak dapat diproteolisis oleh cathepsin.
Ketika sel dilisiskan, mekanisme pengaturan terganggu dan organel dapat rusak. Protease yang biasanya tidak bersentuhan dengan sebagian besar protein tidak lagi diasingkan.
Lebih lanjut, mekanisme seluler penghambatan protease terganggu, sehingga protease aktif dapat membelah berbagai protein yang tidak bekerja pada sel utuh.
Karena banyaknya jumlah dan jenis protease dalam organisme yang biasa digunakan untuk ekspresi protein, mudah untuk membayangkan bahwa protein dapat mengalami proteolisis ekstensif setelah lisis sel.
Oleh karena itu, perlu dilakukan tindakan untuk mencegah proteolisis protein selama pemurniannya, sehingga protein fungsional panjang penuh diisolasi untuk digunakan dalam studi eksperimental.
Inhibitor protease umumnya digunakan dalam jenis penelitian ini, dan jenis inhibitor yang digunakan tergantung pada jenis protease yang perlu dihambat.
Klasifikasi protease
Protease dicirikan dalam berbagai cara. Protease dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme kerjanya dan spesifisitas substratnya.
Peringkat umum
Secara umum, protease dapat dicirikan sebagai endopeptidase atau exopeptidases:
Endopeptidase memotong ikatan di dalam protein dan umumnya sangat spesifik untuk urutan asam amino tertentu.
Exopeptidases membelah asam amino tunggal dari ujung protein, dan kurang spesifik terhadap asam amino yang dibelah.
Exopeptidases mengklasifikasikan diri mereka sebagai mereka yang mengikat hanya dari C-terminus (carboxypeptidases), hanya dari N-terminus (aminopeptidases), atau keduanya termini (dipeptidases).
Baik endopeptidase dan eksopeptidase bisa sangat bermasalah selama pemurnian protein. Endopeptidase dapat mengenali daerah dalam protein yang diinginkan dan melakukan proteolisis untuk mencerna protein menjadi banyak bagian yang lebih kecil yang tidak berguna dalam studi eksperimental.
Eksopeptidase juga bisa sangat bermasalah selama pemurnian, dan penghilangan hanya beberapa asam amino seringkali tidak dapat dideteksi dengan metode umum.
Mekanisme Proteolisis
Protease juga dicirikan oleh mekanisme kerjanya; yaitu, asam amino yang terlibat dalam situs katalitik enzim.
Situs katalitik mengandung asam amino yang secara langsung berperan dalam memfasilitasi hidrolisis ikatan peptida. Proses ini membutuhkan nukleofil untuk memulai reaksi, yang dapat berupa rantai samping asam amino situs aktif atau molekul air.
Selama tahap selanjutnya dari proteolisis, kedua peptida dilepaskan dan situs aktif protease kembali ke keadaan awalnya, siap untuk mengikat substrat lain untuk proteolisis.
Protease biasanya dikelompokkan menjadi empat kelas utama berdasarkan residu situs aktifnya:
protease serin.
Sistein (tiol) protease.
protease aspartat.
Metaloprotease.
Protease serin dan sistein (tiol) memiliki asam amino di dalam situs aktif yang melakukan serangan nukleofilik awal, sedangkan protease aspartat dan metaloprotease mengaktifkan molekul air untuk melakukan serangan nukleofilik awal.
Protease serin bekerja melalui triad katalitik yang terdiri dari serin, histidin, dan residu aspartat.
Protease sistein (tiol) mengandung angka dua katalitik dengan histidin dan residu sistein. Sistein melakukan serangan nukleofilik untuk memulai hidrolisis ikatan peptida.
Protease aspartat mengandung angka dua katalitik dengan dua residu aspartat.
Metalloprotease membutuhkan ion seng (atau, lebih jarang, ion logam divalen yang berbeda) yang berkoordinasi dengan protein oleh tiga asam amino, yang identitasnya dapat bervariasi.
Ion logam mengaktifkan molekul air sehingga dapat melakukan serangan nukleofilik pada karbon karbonil untuk memutuskan ikatan peptida.
Spesifisitas Ikatan Peptida
Endoprotease secara khusus mengenali asam amino atau jenis asam amino tertentu. Tidak hanya asam amino yang membentuk ikatan peptida yang penting, tetapi residu yang berdekatan juga berperan dalam spesifisitas.
Pengenalan ini dimediasi oleh kantong spesifisitas, daerah dalam protease di sekitar situs aktif yang mengikat beberapa rantai samping asam amino lebih baik daripada yang lain.
Protease mirip tripsin: sebagian besar membelah protein pada sisi karboksil arginin atau lisin (kecuali bila residu tersebut mengikuti prolin).
Protease mirip kimotripsin : lebih suka terfragmentasi pada sisi karboksil dari residu aromatik yang besar (triptofan, tirosin, atau fenilalanin).
Protease mirip caspase : Mereka sebagian besar dibelah di sisi karboksil aspartat, tetapi caspase di Drosophila juga telah terbukti membelah di sisi karboksil glutamat.
Protease tipe elastase : terutama terpisah pada sisi karboksil dari asam amino alifatik kecil (glisin, alanin atau valin).
Inhibitor Protease
Inhibitor protease adalah molekul yang memblokir aktivitas protease dan biasanya berfungsi dalam kelas protease dengan mekanisme aksi yang serupa.
Inhibitor protease dapat berupa protein, peptida, atau molekul kecil. Inhibitor protease yang terjadi secara alami umumnya berupa protein atau peptida.
Inhibitor protease yang digunakan dalam studi eksperimental atau pengembangan obat seringkali berupa molekul kecil atau mirip peptida sintetis.
Banyak protease inhibitor yang berbeda tersedia secara komersial untuk penggunaan eksperimental baik dalam pengujian in vitro dan in vivo dan selama pemurnian protein.
Mekanisme Penghambatan Protease
Inhibitor protease dapat bekerja dengan cara yang berbeda untuk menghambat aksi protease. Inhibitor ini dapat diklasifikasikan berdasarkan jenis protease yang mereka hambat dan mekanisme yang mereka gunakan untuk menghambat enzim.
Sementara protease inhibitor dijual secara komersial sesuai dengan kelas protease yang mereka hambat, memahami berbagai mekanisme kerja inhibitor penting untuk pemahaman menyeluruh tentang penghambatan dan untuk mengembangkan inhibitor protease sebagai strategi terapeutik.
Inhibitor reversibel umumnya mengikat protease dengan beberapa interaksi non-kovalen, tanpa reaksi apapun dari inhibitor itu sendiri. Inhibitor ini dapat dihilangkan dengan pengenceran atau dialisis.
Inhibitor reversibel termasuk inhibitor kompetitif, inhibitor non-kompetitif, dan inhibitor non-kompetitif. Inhibitor kompetitif mengikat ke situs aktif protease, bersaing dengan substrat untuk akses ke residu situs aktif.
Contoh inhibitor kompetitif adalah aprotinin , yang menghambat banyak protease serin. Inhibitor kompetitif sering memiliki struktur yang mirip dengan keadaan transisi substrat alami.
Keadaan transisi substrat adalah struktur yang paling erat berikatan dengan enzim. Oleh karena itu, senyawa yang meniru struktur ini mengikat enzim dengan resistensi yang lebih besar daripada substrat (dalam keadaan awalnya), dan reaksi enzimatik normal tidak dapat dilanjutkan.
Contoh dari jenis analog keadaan transisi ini adalah LP-130, inhibitor protease HIV-1.
Inhibitor non-kompetitif hanya mengikat protease ketika sudah terikat pada substrat. Inhibitor untuk protease HIV-1 dan proteinase virus West Nile NS2B-NS3 telah diidentifikasi yang berfungsi secara non-kompetitif.
Inhibitor non-kompetitif mengikat protease, dengan atau tanpa substrat terikat, dengan afinitas yang sama, dan menghambat aktivitas protease melalui mekanisme alosterik. BBI, penghambat tripsin kedelai, dan aminoglikosida, penghambat protease faktor fatal antraks tidak kompetitif.
Inhibitor ireversibel bekerja dengan secara khusus mengubah situs aktif target spesifik mereka melalui pembentukan ikatan kovalen.
Setelah mengikat inhibitor, situs aktif protease diubah dan tidak dapat lagi menghidrolisis ikatan peptida. Beberapa inhibitor tidak berikatan secara kovalen dengan protease, tetapi berinteraksi dengan afinitas tinggi sehingga tidak mudah dihilangkan.
Contoh dari protease inhibitor bunuh diri adalah keluarga protein serpin, yang berperan dalam pembekuan darah dan peradangan. Sebuah siklus di Serpin berfungsi sebagai substrat analog.
Residu serin di situs aktif tripsin membentuk serangan nukleofilik pada karbon karbonil dari analog substrat, menginduksi perubahan konformasi pada enzim yang membuat sisa reaksi hidrolisis ikatan peptida tidak menguntungkan.
Oleh karena itu, serpin tetap terikat secara kovalen dengan protease sehingga enzim tidak lagi tersedia untuk mengikat substrat.
Jenis Inhibitor Protease
Inhibitor protease dapat dibeli secara individual atau sebagai koktail pekat yang mengandung beberapa inhibitor protease dalam jumlah relatif yang sesuai.
Inhibitor protease individu ideal untuk situasi di mana inhibitor protease diperlukan untuk digunakan dalam uji proteolitik protein yang sudah dimurnikan.
Uji enzim sering memerlukan pemeriksaan untuk menunjukkan bahwa enzim yang diinginkan melakukan tindakan yang diawasi; oleh karena itu, menambahkan inhibitor protease spesifik dapat berfungsi sebagai kontrol.
Membeli inhibitor protease individu juga ideal dalam keadaan di mana protein yang dimurnikan adalah protease. Dalam kasus ini, keberadaan protein fungsional dan kemurnian sering dinilai dengan uji enzimatik.
Untuk jenis pemurnian ini, beberapa protease inhibitor dapat ditambahkan, tidak termasuk yang menghambat protease yang diinginkan. Kebanyakan menawarkan penghambatan luas satu atau lebih kelas protease.
Koktail protease inhibitor sering digunakan karena keandalan dan reproduktifitasnya. Koktail mengandung beberapa protease dalam jumlah relatif yang sesuai, menghilangkan kebutuhan untuk trial and error untuk menentukan jenis yang dibutuhkan dan jumlah inhibitor yang digunakan.
Mereka juga meminimalkan kemungkinan kesalahan manusia dan pemipetan, hanya membutuhkan satu solusi versus beberapa solusi berbeda. Koktail ini tersedia dalam bentuk cair dan padat.
Tablet lengkap Roche adalah salah satu koktail protease inhibitor yang paling umum digunakan. Tablet ini ditambahkan ke volume buffer tertentu untuk menghambat protease yang lebih melimpah.
Tablet lengkap Roche telah terbukti berhasil menghambat berbagai protease dalam lisat dari banyak organisme, termasuk E. coli, ragi, serangga, dan mamalia.
Hasil protein full-length tanpa adanya inhibitor protease kurang dari setengah yang diperoleh dengan penambahan inhibitor protease.
Inhibitor protease dalam bentuk tablet ditambahkan ke volume buffer yang ditunjukkan, dan tablet dilarutkan untuk membawa konsentrasi masing-masing protease inhibitor dalam buffer ke tingkat yang sesuai.
Penambahan inhibitor protease dalam bentuk tablet sangat mudah, karena tidak diperlukan pemipetan.
Dalam kasus di mana volume buffer yang sangat kecil diperlukan, koktail protease inhibitor dalam bentuk cair mungkin lebih cocok untuk menghindari pemborosan buffer berlebih, karena tablet memerlukan persiapan volume tertentu.
Banyak perusahaan juga menjual protease inhibitor secara individual, sebagai koktail, dan sebagai set dari beberapa inhibitor individu. Set ini berguna dalam menentukan inhibitor protease mana yang diperlukan untuk aplikasi tertentu.
Mereka juga dapat berguna ketika inhibitor protease tertentu yang termasuk dalam sebagian besar koktail komersial diketahui mengganggu protein yang diinginkan atau aplikasi hilir.
Inhibitor Protease beraksi
Ada banyak hal yang perlu dipertimbangkan ketika memilih protease inhibitor (s) yang tepat.
Pertimbangan yang paling penting adalah tujuan penghambatan protease, apakah inhibitor diperlukan untuk mencegah proteolisis selama pemurnian protein, untuk menghambat enzim yang dimurnikan sebagai kontrol eksperimental, atau untuk digunakan dalam organisme hidup untuk mempengaruhi proses fisiologis.
Bagian berikutnya mencakup beberapa pertanyaan dan perhatian penting untuk dipertimbangkan saat menggunakan PI.
Inhibitor protease apa yang harus saya gunakan?
Kegunaan memainkan peran penting dalam jenis protease inhibitor yang akan digunakan.
Untuk uji in vitro dan in vivo, pilihan protease inhibitor tergantung pada enzim tertentu atau proses fisiologis yang dipelajari. Untuk pengujian enzim, inhibitor tidak boleh mengganggu metode deteksi.
Meskipun jika penghambatan bersifat reversibel, dan metode deteksi lain tersedia (misalnya elisa), mungkin tidak masalah apakah protein target dihambat selama pemurnian selama inhibitor tidak ada pada sediaan akhir.
Perlu dicatat bahwa beberapa inhibitor protease tidak spesifik untuk protease. Misalnya, PMSF secara ireversibel menghambat banyak, tetapi tidak semua, anggota keluarga serin hidrolase.
Keluarga ini, sementara termasuk protease seperti tripsin dan kimotripsin, juga mencakup banyak enzim lain yang menghidrolisis substrat non-protein (misalnya, asetil kolinesterase, hidrolase asil-KoA, dan lipase).
Untuk studi pada organisme hidup, inhibitor harus permeabel sel, sangat spesifik, dan tidak beracun. Untuk penghambatan luas protease untuk membantu memurnikan protein fungsional full-length, beberapa protease biasanya diperlukan.
Bagaimana seharusnya Protease Inhibitor disiapkan dan disimpan?
Banyak protease inhibitor tidak stabil untuk jangka waktu yang lama, baik sebagai larutan stok atau pada konsentrasi kerjanya.
Sangat penting untuk menyiapkan solusi sesuai dengan instruksi pemasok, karena beberapa protease inhibitor lebih stabil daripada yang lain dalam kondisi tertentu.
Biasanya, jika larutan stok telah disimpan seperti yang disarankan dan larutan kerja disiapkan segera sebelum digunakan, inhibitor harus mempertahankan fungsi yang memadai.
Beberapa inhibitor protease, seperti PMSF, sangat tidak stabil dan harus ditambahkan beberapa kali selama lisis dan pemurnian untuk memastikan penghambatan protease.
Bagaimana fungsi Protease Inhibitor dikonfirmasi?
Berbagai perusahaan menjual reagen sebagai ukuran untuk memverifikasi fungsi protease, dan ini dapat digunakan untuk mengkonfirmasi penghambatan yang memadai.
Roche menjual substrat protease universal, yang menggunakan uji absorbansi untuk memantau degradasi kasein berlabel resorufin. Substrat ini dapat digunakan jika ada bukti dugaan penghambatan protease yang tidak memadai.
Biasanya, lebih baik menggunakan waktu dan energi untuk membuat larutan inhibitor protease segar jika protease diduga masih berfungsi.
Namun, jika proteolisis merupakan masalah yang berulang, substrat komersial ini dapat membantu menentukan kondisi yang paling tepat untuk penghambatan protease.
Selama lisis sel dan pemurnian protein, kapan Inhibitor Protease harus ditambahkan?
Inhibitor protease harus ditambahkan ke buffer lisis sehingga penghambatan dapat terjadi segera setelah lisis sel, ketika protease dilepaskan dari kompartemen selnya dan regulasi terganggu.
Inhibitor protease ini harus tetap berada dalam buffer awal yang digunakan dalam skema pemurnian sampai dapat diasumsikan bahwa sebagian besar protease yang mencemari telah cukup terpisah dari protein yang diinginkan.
Biasanya, jika langkah kromatografi pertama ketat (misalnya, kromatografi afinitas), inhibitor protease hanya perlu ada melalui langkah pencucian dari prosedur kromatografi ini.
Buffer elusi dan buffer pemurnian yang tersisa biasanya tidak memerlukan protease inhibitor.
Ini merupakan pertimbangan keuangan yang penting untuk upaya pemurnian protein skala besar di mana sejumlah besar buffer mungkin diperlukan.
Bahkan untuk laboratorium industri yang didanai dengan baik, penyertaan inhibitor protease konsentrasi tinggi di seluruh pemurnian skala besar bisa sangat mahal.
Namun, banyak protease merupakan katalis yang sangat efisien dengan angka turnover yang tinggi, dan oleh karena itu jika sejumlah kecil protease dimurnikan bersama dengan protein target, hal itu dapat menyebabkan masalah.
Ini mungkin terlihat sebagai degradasi protein target yang jelas atau mungkin tidak terlihat sampai terminal-N atau analisis spektroskopi massa mengungkapkan bahwa persiapan protein yang dimurnikan mengandung berbagai spesies dengan ujung terminal-N yang berbeda.
Untuk banyak aplikasi, mikroheterogenitas seperti itu mungkin tidak menjadi masalah, sementara untuk yang lain dapat menyebabkan masalah yang signifikan.
Misalnya, dalam konteks biologi struktural, heterogenitas terminal-N seperti itu dapat memengaruhi kemampuan untuk mengkristalkan protein dan/atau kualitas kristal yang diperoleh.
Oleh karena itu, dalam beberapa kasus mungkin perlu untuk memasukkan inhibitor terhadap satu atau lebih kelas protease dalam langkah selanjutnya dari protokol pemurnian.
Penggunaan uji protease (seperti yang dibahas di atas) dapat digunakan untuk mengidentifikasi kelas protease yang akan diblokir.
Apa lagi yang bisa dilakukan untuk menghentikan Proteolisis?
Lisis dan pemurnian sel harus dilakukan pada suhu rendah. Biasanya, lisis dan pemurnian dilakukan pada 4 ° C. Ini tidak hanya membantu pelipatan dan stabilitas protein, tetapi juga memperlambat laju proteolisis dengan mengkontaminasi protease.
Lebih jauh lagi, semakin cepat protease yang mengkontaminasi dihilangkan dari protein yang diinginkan, semakin sedikit waktu yang mereka miliki untuk berinteraksi dan kemungkinan mendegradasi protein. Jangan biarkan lisat sel duduk, bahkan di atas es, untuk waktu yang lama.
Lanjutkan dengan langkah pemurnian secepat mungkin dan simpan protein murni dengan tepat.
Jika proteolisis protein rekombinan merupakan masalah khusus, sejumlah pendekatan dapat dipertimbangkan. Untuk ekspresi E. coli, mungkin saja menurunkan suhu pertumbuhan mengurangi proteolisis protein target yang terjadi sebelum pemanenan dan lisis sel.
Mungkin juga untuk mengurangi proteolisis intraseluler dari protein target dengan mengarahkan ekspresi ke periplasma dan dengan demikian mengurangi paparan protease intraseluler.
Demikian pula, untuk menghindari proteolisis oleh protease mamalia intraseluler, dimungkinkan untuk menggunakan sistem ekspresi yang mengarahkan sekresi protein rekombinan ke media kultur.
Mempertimbangkan berbagai protease yang dihasilkan oleh organisme yang berbeda, mungkin juga untuk mengurangi, atau bahkan menghilangkan, masalah proteolisis dengan mengubah ekspresi ke organisme inang yang berbeda (misalnya, E. coli menjadi baculovirus / sel serangga).
Jika saya tidak tahu protease inhibitor mana yang harus digunakan, dari mana saya harus memulai?
Tempat terbaik untuk memulai dalam memilih kombinasi inhibitor yang tepat untuk digunakan selama lisis sel dan pemurnian protein adalah dengan mencoba campuran inhibitor yang umum digunakan. Untuk sebagian besar lisat dan aplikasi, ini sudah cukup.
Namun, jika protein panjang penuh tidak diperoleh atau jika masalah dialami dalam aplikasi berikutnya, inhibitor protease individu atau set inhibitor protease dapat digunakan untuk menentukan kombinasi inhibitor protease yang paling tepat.
Inhibitor Protease dalam Praktik Klinis
Inhibitor diuji dalam beberapa uji klinis.
Secara khusus, beberapa subtipe struktural penghambat triptase (TI) menunjukkan efek terapeutik yang menjanjikan untuk penyakit paru-paru. Mekanisme tindakan mereka termasuk perlekatan kovalen residu serin dalam domain aktif atau aspartat yang mengikat dan pembentukan ikatan hidrogen.
IT berbasis Benzena sulfenamida terbukti efektif menekan reaksi alergi paru, seperti bronkospasme akut, pada caral hewan.
TI yang mengandung dipeptida efektif dalam mengurangi patologi yang dimediasi asma dan fibrosis hati.
Selain itu, IT berbasis guanidino diuji sebagai pengobatan tambahan untuk kolitis ulserativa. Selain itu, TIS yang mengandung beta-laktam dapat digunakan untuk mengurangi peradangan paru-paru.
Berkenaan dengan penyakit kardiovaskular, subtilsin-kexin tipe 9 penekan convertase terbukti menurunkan lipoprotein densitas rendah dan disetujui untuk pengobatan pasien dengan hiperlipidemia berat.
Selain itu, penekan dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) dapat secara efektif menurunkan kadar glukosa dan digunakan untuk pengobatan pasien dengan diabetes tipe 2.
Selanjutnya, linagliptin inhibitor DPP-4 terbukti menekan perkembangan retinopati diabetik dalam caral eksperimental.
Selain itu, penghambat sistein protease cathepsin K meningkatkan kepadatan mineral tulang pada individu dengan osteoporosis pascamenopause. Selanjutnya, sudator cathepsin K odanacatib menurunkan resorpsi tulang pada pasien pria dan wanita dengan osteoporosis.